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亚细胞成分的差速离心分离 ((/为沉降系数(/01&%0’232&4’ 54066&5&0’2),干式恒温仪单位为秒。一般蛋白质沉降系数的数量级为 !" !+ 7!" !* /, 人们以8901:0;<(8)单位来表示沉降系数,即 !8=!" !+ /。沉降系数的大小与蛋白质的密度与形状相关 (表 *,)。 表 ! "#几种蛋白质的相对分子质量与沉降系数的关系 蛋白质分子相对分子质量沉降系数(> 8) 核糖核酸酶 !* ,"" !? -$ 细胞色素 5 !$ @"" !? ," 肌红蛋白 胃蛋白酶 !. *"" +. """ *? ") +? + !乳球蛋白 卵白蛋白 马血红蛋白 人血清白蛋白 血纤维蛋白原 )! $"" )) """ @-""" @, """ ++" """ +? !* +? $$ )? )! )? @ .? , 脲酶 猪甲状腺球蛋白 )-" """ @+" """ !-? @ !,? * ( ( *?透析与超滤 ((利用具有半透膜性质的透析袋将大分子的蛋白质与小分子化合物分离的方法称为透析( 1&3AB/&/)。 透析袋的截留极限一般
在相对分子质量 $ """左右。将含有大相对分子质量蛋白质的溶液装入透析袋 内,再将透析袋置入水(或某种缓冲液)中,这样,小相对分子质量的物质(无机盐、有机溶剂、小相对分子 质量的抑制剂等)便可透过透析薄膜进入水中,大相对分子质量的蛋白质留在透析袋内。透析过程中要 更换 +次 7$次袋外的透析液,以使透析袋内的小分子物质全部去除。有时将装有高相对分子质量蛋白 质溶液的透析袋包埋入吸水剂(如聚乙二醇)内,袋内的水与小分子物质可被吸出透析袋,达到将袋内蛋 白质浓缩的目的。 ((超滤(CA2;36&A2;32&4’)是在一定的压力下,使蛋白质溶液在通过一定孔径的超滤膜时,小相对分子质量 物质滤过,而大相对分子质量的蛋白质被截留,从而达到分离纯化的目的。这种方法既可以纯化蛋白质, 又可达到浓缩蛋白质溶液的目的。 ( ( +?凝胶过滤 ((凝胶过滤(<0A 6&A2;32&4’)又称分子筛层析,在层析柱内填充惰性的微孔胶粒(如交联葡聚糖),将蛋白 第二章 #蛋#白#质"! 质溶液加入柱上部后,小分子物质通过胶粒的微孔进入胶粒,向下流动的路径加长,移动缓慢;大分子物质 不能或很难进入胶粒内部,通过胶粒间的空隙向下流动,其流动的路径短,移动速率较快,从而达到按不同 相对分子质量将溶液中各组分分开的目的(图 ! !")。 图 ! !"#凝胶过滤分离蛋白质 # #(三)根据蛋白质电荷性质的分离方法 # #可以根据各种蛋白质在一定的 $%环境下所带电荷种类与数量不同的特点,分离不同蛋白质。常用 的方法有离子交换层析、电泳和等电聚焦。 # #&’离子交换层析 ##离子交换层析(()* +,-./*0+ -.1)2/3)01/$.4)应用广泛,是蛋白质分离纯化的重要手段之一。离子交 换层析的填充料是带有正(负)电荷的交联葡聚糖、纤维素或树脂等。根据层析柱内填充物(交换剂)的电 荷性质不同,离子交换层析可分为阴离子交换层析和阳离子交换层析。阴离子交换层析的交换剂本身带 正电荷,而阳离子交换层析的交换剂带负电荷。 ##以阴离子交换层析为例(图 ! !5),将阴离子交换葡聚糖填入层析柱内,由于此种葡聚糖颗粒本身带 有正电荷,吸附溶液中带负电的蛋白质阴离子。若用带有不同浓度的阴离子(如 67)溶液进行洗柱。洗 脱液中的阴离子取代蛋白质分子与交换剂结合。低盐浓度时带电少的蛋白质被优先洗脱下来,随着洗脱 溶液中阴离子浓度的不断升高,带电多的蛋白质也不断地被先后洗脱下来。若用不同
$%的缓冲液进行 洗柱,随着层析柱内溶液 $%的变化,达到或接近其等电点的蛋白质由于不带电荷而被洗脱下来。这样, 利用离子交换层析,便将在洗脱过程中带电程度不同的蛋白质分离开来。 # #!’电泳 ##溶液中的带电粒子在电场中的迁移称为电泳(+7+-31)$.)1+8(8)。蛋白质在低于或高于其等电点时分别 带正电荷或负电荷,在电场中向阴极或阳极迁移。根据蛋白质分子大小和所带电荷的不同,可以通过电泳 将其进行分离。根据支持物的不同,电泳有薄膜电泳、凝胶电泳等。薄膜电泳的支持物是滤纸或醋酸纤维 素薄膜等。 ##最常用的凝胶电泳有琼脂糖电泳( /0/1)8+ +7+-31)$.)1+8(8)和聚丙烯酰胺凝胶电泳( $)74/-147/2(9+ 0+7 +7+-31)$.)1+8(8,:;<=)。这些支持物可以附于玻璃板上或玻璃柱中, :;<=还具有分子筛作用。人们常用 "!第一篇 #生物分子的结构与功能 图 ! !"#离子交换层析分离蛋白质 十二烷基硫酸钠( $%&’() &%&*+,-$(-./0*,121)将欲分离的蛋白质分解为亚基,并由于 121是负电性很强的 物质,它可使所有的亚基均带上大致相等的负电荷。这样,在具有分子筛作用的 3456中,各种蛋白质的 泳动速率仅仅取决于其分子大小。这种电泳称为 121 3456。如有已知相对分子质量的标准蛋白质作 对照,就可用于测定蛋白质相对分子质量。电泳后,用蛋白质显色剂显色,可以清楚地看到已分离的各条 蛋白质区带。 # #79等电聚焦 ##等电聚焦(’$%*-*+0:’+ .%+($’;<,=6>)与一般电泳的区别在于, =6>是在具有 ?@梯度的电场中进行的电 泳,蛋白质按其等电点不同予以分离。每种蛋白质均有其特定的等电点,在 ?@呈梯度的电场中,按其等 电点不同,带有不同的电荷,于是向与其带电相反的电极方向泳动。这样,在电泳时某一蛋白质迁移到电 场中 ?@等于其等电点的位置时,该蛋白质便因不带电荷而停止泳动。这样,各种蛋白质按其等电点不同 图 ! 78#蛋白质的双向电泳示意图 第二章 !蛋!白!质!! 得以分离。 ! !"#双向电泳 !!双向电泳($%& ’()*+,(&+-. *.*/$0&12&0*,(,,3 45)
是利用不同蛋白质所带电荷和质量的差异,用两 种方法、分两步进行的蛋白质电泳。第一步是以聚丙烯酰胺凝胶为支持物,在玻璃管中进行 657,使蛋白 质按其不同的等电点进行分离。第二步是将 657的胶条取出,横放在另一平板上,进行 848 9:;5。第 二次电泳的方向与 657垂直,使已按 657分离的蛋白质再进行一次按其不同质量的再分离(图 3 <=)。3 45的分辨率很高,可将大肠杆菌提取液分离出 > "==多个蛋白点,每个点基本上代表一种蛋白质。 45是研究蛋白质组不可缺少的工具。 第五节 !蛋白质组与蛋白质组学 一、蛋白质组 !!蛋白质是生命活动的物质基础,生命活动主要通过蛋白质的功能来体现。遗传信息的传递与表达都 需要蛋白质的参与才能实现。随着人类基因组计划的完成,人类基因组精确图的公布,生命科学已进入了 后基因组时代,人们把目光转向探索蛋白质组(10&$*&)*)的工作。 !!蛋白质组的概念是澳大利亚学者 ?# @# A(.B(+,和 C# D# A(..(-),于 >EE"年首先提出来的。蛋白质组 是指一个组织或一个细胞中基因组所表达的全部蛋白质。更确切地说,蛋白质组是指在特定条件下,一个 细胞内所存在的所有蛋白质。蛋白质组比基因组复杂得多。人们推测,人类基因组虽然包含约 "= ===个 基因,却可编码 3F万 G F=万种蛋白质。人的一种细胞内存在的蛋白质总数约为 ># F万种,且不同种的细 胞中所包含的蛋白质又不完全相同。所以,已知一个基因组序列并不表明可以识别这个基因组所编码的 全部蛋白质和各种细胞内实际的蛋白质种类。即使基因组的序列可以用于预测其阅读框,但还是不能准 确地掌握其所表达的蛋白质。这是因为基因组中各基因的序列不能反映蛋白质翻译后的剪切与加工修 饰。翻译生成的 )@H:经不同的剪接,可以生成不同的蛋白质序列。而且翻译后的蛋白质还存在修饰加 工过程。因此,只有知道细胞在不同发育时期、不同生理和病理状态下全部蛋白质的结构与功能,才有可 能最后反过来明了基因组中各基因的真正功能。 !!此外,同一生物个体不同体细胞中的基因组具有均一性,而蛋白质组则不同,蛋白质组具有时、空差 别。在个体的发育过程的不同阶段,各种基因的表达与关闭各不相同,同一类细胞所包含的蛋白质会有质 和量的差异。同一个体的不同体细胞中蛋白质的种类和数量也各不相
同。组织细胞在分化过程中,正是 由于不同组织细胞中基因表达的质和量的不同,各组织器官各有其特有的蛋白质,才出现千差万别的组织 形态和功能表现。另外,即使是成年个体,由于组织细胞处于不同的生命活动状态(如运动、禁食、饱食等 物质代谢的不同状态),同一细胞内的蛋白质成分和数量也有不同之处。此外,在病理条件下,病人发病、 治疗与转归等过程中,细胞中蛋白质组也会与正常生理状态有所不同。 !!对于同一种蛋白质来说,在不同的生理和病理条件下,即使其一级结构不变,也可能出现空间结构的